蜜环菌的菌种分离可采用组织分离、孢子分离（单孢、多孢）、菌索分离、基质分离及共生体（天麻）分离。
1.组织分离法组织分离法是利用蜜环菌的子实体菌肉组织作为材料而获得纯种的方法，是一种最简便的方法，也是野外采种较常用的方法。
选取生长良好，八成熟的子实体，以朵大，菇数较多，无病虫害的单菇作为分离材料。选好种菇之后，从菇柄中部剪下，放入无菌皿，放入无菌箱中，用75%的酒精消毒之后，用无菌水反复冲洗，然后用无菌吸水纸吸去表面的水分，从中间撕开，用无菌镊子夹取一小块菌肉组织放入平板培养基或斜面上，在25℃环境中培养5～7天，便可看到白色丝状菌丝长出，若无杂菌生长表明分离成功。
2.菌索分离有时蜜环菌的子实体不易获得，可以采用菌索来分离。这是蜜环菌菌种分离最常用的方法。分离前要选择生长健壮，粗而长，菌鞘表面黑里透红，且有光泽的菌索作为分离材料。
分离时，取一段（3～5cm）菌索置于无菌皿，放入无菌箱，用75%的酒精消毒，再用无菌水冲洗2～3次，然后用无菌纸吸去表面水分，用无菌镊子去掉黑色的外皮层（菌鞘）。若菌索较细，也可以不去菌鞘，将其中白色菌髓部分，用无菌剪刀剪成2～3mm的小段，移植在培养基上保温培养，即可得到蜜环菌的菌种。
3.基质分离基质分离应选择菌棒表面菌索较多或菌棒的断面在夜间荧光较强的菌棒作为分离材料。
分离时截取菌棒0.5～1cm，去掉周围一层，放入无菌箱中，以0.1%升汞消毒，然后用无菌刀切成小块，移植在培养基上，保温培养，也可得到蜜环菌菌种。但这种方法若菌棒选择不好，污染较多，一般不常采用。
4.共生体分离选取个体较大，表面有许多蜜环菌菌索的白麻或箭麻作分离材料。分离时，将天麻置于干净的水中，清洗干净放入无菌箱中消毒冲洗之后，用无菌小刀取皮下组织一小块，移植在培养基上，保温培养即可。
5.孢子分离孢子分离时种用子实体的选择与组织分离相同，分离方法又可分为以下几种：
（1）孢子弹射分离法此法是利用子实层能自动弹射出孢子的特性来收集分离孢子。根据不同的装置又分为三种。
①整菇插种法。将一株子实体经表面消毒后，插入孢子收集器内收集孢子，在无菌操作下，将孢子稀释成悬浮液，接入培养基培养即可。
②钓悬法。取新鲜蜜环菌子实体，消毒冲洗后，吸干表面水分，取菌盖或菌盖的一部分挂在钓子上。钓子的另一端挂在三角形瓶口，使分离材料悬挂在三角瓶内，勿使分离材料碰到瓶壁，瓶内装有PDA培养基。在25℃温度下培养24h，待成熟孢子落到培养基上后，再把三角瓶拿到无菌箱，取出菌盖，塞上棉塞，继续培养或把孢子转到试管中培养。
③贴附法。取一小块成熟的菌褶或小块菌盖，用溶化的无菌琼脂，贴附在斜面培养基的正上方（试管壁上）或培养皿皿盖上，经6～12h，待孢子落下后，把试管或培养皿中的培养基移到另一消毒过的斜面或培养皿中进行培养。
（2）菌褶涂抹法取成熟的子实体，切去菌柄基部，放入接种箱中进行表面消毒，用接种环插入两片菌褶之间，轻轻地抹过菌褶表面，然后用划线法涂抹于斜面培养基上培养即可。
（3）孢子印分离法取成熟的子实体经表面消毒，切去菌柄，菌褶向下，置于灭过菌的有色纸上，用通气钟罩罩上，在20～24℃室温下静置24h，大量孢子便落在灭过菌的纸上，形成孢子印。再从孢子印上挑取少量孢子，接种于斜面培养基上培养。
（4）空中孢子捕捉法待蜜环菌的子实体成熟，大量孢子弹射时，子实体周围可形成“孢子云”，可在“孢子云”飘去的上方倒放琼脂平板，使孢子黏附其上，再盖上皿盖培养。
（5）单孢子分离方法从许多孢子中挑出单个孢子，一般需用单孢子分离器，如无单孢分离器，也可用以下方法获得单孢子。
①平板稀释法。挑取少许孢子放在无菌水中，充分振荡孢子悬浮液，然后吸取几滴孢子液于PDA培养基上，用无菌玻璃刮铲涂抹，经48～72h后，镜检平板背面，观察孢子萌发情况，并在单个孢子旁做好标志，继续培养到成小白点后，转接到斜面培养基上继续培养。
②连续稀释法。用接种针挑取一定量的孢子，洗入10ml无菌水中摇匀，从中取出1ml孢子液，加入9ml无菌水中，以此类推。一直稀释到在低倍镜下一个视野内只有1～2个孢子时，用无菌注射器把孢子液滴到斜面上，每个斜面上滴1～2滴，使孢子液流下，保温培养。发现单个菌落时，立即转移到新的斜面培养基上继续培养。
③毛细管法。用玻璃毛细管吸取稀释后的孢子悬浮液，滴在无菌培养皿盖壁上，点样的地方做好标志，点样后的培养皿盖在有琼脂培养基的底皿上。镜检后，确定液滴是单孢子者，做好标志，取一小块培养基，放在单孢液滴旁，轻轻推动接触液滴，注意不可盖上液滴，以免影响孢子发芽，待孢子萌发之后，鉴定是否为单核菌丝。
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